Will man ein biologisches Präparat, dessen Brechungsindex nahe n = 1,33 (Wasser) liegt, mit einem hochaperturigen Objektiv untersuchen, so kann ein Öl-Objektiv nur dann ein brauchbares Ergebnis liefern, wenn man nicht zu tief in das Präparat hineinfokussiert.
Möchte man tiefer in das Präparat hineinsehen, werden starke sphärische Aberrationen den Kontrast und die Auflösung zunichte machen. Ebenso wird die Helligkeit drastisch reduziert, was sich insbesondere in der konfokalen Mikroskopie durch eine starke Verschlechterung des Signal-Rausch-Verhältnisses bemerkbar macht.
Daher ist ein noch so gutes Öl-Objektiv für ein wasserähnliches Präparat nicht optimal. Bei der Berechnung von Objektiven spielt der Brechungsindex des Präparates (und des Immersionsmediums) eine wesentliche Rolle.
Bei der Korrektionsrechnung eines Öl-Objektives geht man davon aus, dass die Brechungsindices des Immersionsmediums und des Einbettungsmediums gleich sind (n = 1,52). Bei Wasserobjektiven wird bei der Berechnung ein Brechungsindex von n = 1,33 für Immersions- und Einbettungsmedium angenommen.
Besonderheiten in der Objektiv-Palette:
Objektive C-Apochromat 40x und 63x von UV bis IR korrigiert!
Weitere Wasser-Immersionsobjektive:
Für die Verwendung ohne Deckglas:
- Objektive Achroplan W, die für die Verwendung ohne Deckglas und für lange Arbeitsabstände korrigiert sind, insbesondere bei aufrechten Mikroskopen für Mikroinjektion und patch-clamp.
- Objektiv Plan-Apochromat® W 63x/1.0 von VIS bis IR korrigiert.
Für die Verwendung mit Deckglas:
- Multiimmersionsobjektive LCI Plan-Neofluar, die für Immersionsmedien mit Brechzahlen zwischen Wasser und Öl geeignet sind und für eine Deckglasdicke korrigiert sind.
Soll ein wäßriges Präparat bei hohen Anforderungen mikroskopiert werden, beispielsweise mit einem Laser Scanning Mikroskop, so sind eine Reihe spezieller Bedürfnisse zu befriedigen:
- Hohe Apertur für hohe Auflösung bei feinen optischen Schnitten und hohe Fluoreszenzhelligkeit
- Langer Arbeitsabstand für 3D-Untersuchungen
- Geringe chromatische Längsaberration, damit sich die Fokusebenen unterschiedlicher Farben decken
- Geringe chromatische Vergrößerungsdifferenz, damit unterschiedliche Fluoreszenzen deckungsgleich abgebildet werden
- Ebenes Sehfeld, damit wirklichkeitsgetreue 3D-Rekonstruktion möglich wird
Um diese Anforderungen zu erfüllen, wurde das C-Apochromat 40x/1,2W Korr mit folgenden Eigenschaften entwickelt:
- Wasser-Immersion für wässrige Proben (vitale Schnitte, Kulturzellen, Präparate mit wässrigem Einbettungsmedium)
- Korrektionsring zur Korrektur von Deckglasdickenunterschieden (0,14...0,18 mm) und zur Korrektur unterschiedlicher Temperaturen (Skalen für 24ºC und 37ºC)
- Der Korrekturring kann auch zur Anpassung an geringe Abweichungen des Präparats vom Brechungsindex des Wassers benutzt werden
- Vergrößerung 40x
- Numerische Apertur 1,2
- Freier Arbeitsabstand 220 Mikrometer
- Bildfeldebnung 25 mm (konventionell) bzw. 12 mm (konfokal)
- Transmission (absolut): 50 % bei 350 nm, 85 % bei 400 nm, 90 % bei 500...700 nm
- Hohe chromatische Korrektur (entsprechend Objektiven Plan-Apochromat)
- Keine sphärische Aberration in wäßrigen Proben
Hintergrund
Wenn die Brechungsindices von Einbettungs- und Immersionsmedium nicht übereinstimmen, wird der optische Weg unterschiedlich lang sein. Je nachdem, ob man nur wenig oder tief in das Präparat hineinfokussiert, ist der Unterschied vernachlässigbar oder deutlich. Das hat wesentliche sphärische Aberrationen zur Folge, die zu ganz erheblichen Verlusten in Schärfe, Kontrast, Helligkeit und Tiefenauflösung führen. Zudem wird bei Messungen in axialer Richtung der Maßstab nicht korrekt wiedergegeben. Das führt zu Stauchungen oder Streckungen entlang der Z-Achse. Um die Z-Verformung zu unterbinden müssen die Brechungsindices übereinstimmen. Eine anschließende Korrektur durch den Rechner ist nur ein Notbehelf, da die sphärischen Aberrationen nicht korrigiert werden können. Deshalb muss die Immersion dem Präparat angepasst werden.
Objektive mit derart hohen Aperturen (für Wasser ist 1,2 die obere Grenze) sind jedoch sehr empfindlich, was unterschiedliche Deckglasdicken angeht. Daher besitzt das Objektiv einen Korrektionsring, mit dem Deckgläser zwischen 0,14 mm und 0,18 mm Dicke angepasst werden können. Aus Gründen der maximalen optischen Leistung ist es aber angebracht, Deckgläser mit engen Toleranzen zu benutzen (z.B. 0.16...0.17). Bei der Verwendung im Laser-Scanning-Mikroskop kann die Deckglasdicke einfach gemessen und die Korrektion daher sehr genau eingestellt werden.